Dopinganalytik von Peptidhormonen

von Prof. Dr. Mario Thevis

Seit biotechnologische Innovationen die ­rekombinante ­Herstellung synthetischer und naturidentischer Peptidhormone ­ermöglicht ­haben, ist eine ­Vielzahl neuer hochwirksamer
Medikamente eingeführt worden.

Diese erlauben es, verschiedene Krankheitsbilder wie ­diabetes mellitus oder Anämie zu bekämpfen und deutlich verbesserte Lebensqualitäten bei erkrankten Personen zu schaffen. Einige dieser Produkte, zu denen beispielsweise schnell- und langwirksame Insuline oder Erythropoietin (EPO) zählen (Abb. 2), besitzen ein großes Missbrauchs-Potenzial und gehören zur Gruppe verbotener Wirkstoffe im Leistungssport. Um einen möglichen Missbrauch zu überprüfen und einzudämmen, wurden verschiedene analytische Methoden etabliert, die auf unterschiedlichen Strategien beruhen.

Erythropoietin

Da EPO die Produktion der Erythrozyten im menschlichen Organismus stimuliert und eine hohe Anzahl dieser roten Blutkörperchen beim Ausdauersport von besonderer Be­deutung ist, ist in den vergangenen Jahren eine Vielzahl von Verstößen gegen die Dopingregulierungen mit EPO aufgetreten. Entdeckt werden EPO und künstliche Analoga bevorzugt mittels immunologischer Methoden, d.?h. Urinproben, die zu Dopingkontrollzwecken genommen wurden, werden auf­konzentriert und urinäre Proteine wie körpereigenes aber auch missbräuchlich verwendetes EPO mithilfe der sogenannten isoelektrischen Fokussierung (IEF) getrennt und visualisiert. Ein typisches Beispiel einer solchen Analyse ist in Abb. 1 dargestellt, wobei körpereigenes EPO in der mittleren Region des IEF Gels vorzufinden ist und Varianten sich entweder oberhalb oder unterhalb des natürlichen EPOs durch mehrere Banden zeigen.

Insuline

Die Therapie des diabetes mellitus mittels Insulin-Substitution ist ein häufig verwendetes Verfahren und setzt mehr und mehr auf synthetische schnell- und/oder langwirksame Insuline. Diese können u. a. aufgrund der antikatabolen Eigenschaft des Insulins zu Dopingzwecken verwendet werden und sind daher im Sport verboten. Der Nachweis dieser vergleichbar kleinen Peptidhormone erfolgt sowohl in Blut als auch Urin, indem die Zielanalyten mit insulinspezifischen Antikörpern isoliert werden und anschließend mit Massenspektrometrie identifiziert werden. Dabei werden das Molekülgewicht und Teile der Aminosäuresequenz der Insuline bestimmt, die eindeutigen Aufschluss über eine mögliche Verwendung von Insulin-­Therapeutika geben, wie in einem sogenannten Massen­spektrum in Abb. 3 dargestellt. Natürliches Insulin wird von modifizierten Analoga eindeutig differenziert und solange kein Gebrauch aufgrund einer Diabetes-Erkrankung indiziert ist, wird ein Dopingverdacht erhoben und Sanktionen eingeleitet.

Manipulation

Dopinganalysen können nur Substanzen in Kontrollproben auffinden, die sich zum Zeitpunkt der Analytik in entsprechenden Urinen befinden. Ein kürzlich aufgekommener ­Verdacht einer neuartigen Manipulation deutet auf die ­Verwendung von Proteasen hin, d.?h. auf Enzyme, die höchst effizient Peptidhormone und Proteine zerstören können. ­Sollten solche Proteasen während der Urinabgabe in Dopingproben eingebracht werden, können diese sämtliche urinären Proteine und somit auch missbräuchlich eingesetzte Peptidhormone vernichten und für die Analytik unsichtbar machen. Beispiele von Urinproben mit und ohne Protease-Zugabe sind in Abb. 4 dargestellt. Während der unveränderte Urin (A) deutliche Banden verschiedener Proteine zeigt, sind in den Analysen B (Zugabe Protease 1), C (Zugabe Protease 2) und D (Zugabe Protease 3) signifikante Abnahmen aller Proteine zu verzeichnen. Mit Ausnahme der Protease 2 hinterlassen jedoch alle Proteasen eindeutige Spuren in Form eigener ­Proteinbanden, die mithilfe moderner massenspektrometrischer Analysen identifiziert werden können und bei körperfremder Struktur (z. B. pflanzlicher, tierischer oder vollsynthetischer Herkunft) als Manipulationsversuch erkannt werden.

Dr. Mario Thevis

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